實驗名稱：聲化學誘導艾氏腹水瘤細胞凋亡機制初探

　　研究方向：生物醫學

　　測試目的：

　　聲動力學療法(Sonody namic therapy，SDT)是利用超聲(Ultrasound，Us)具有深部穿透及准確聚焦于生物組織局部的能力，激活相對無毒並且能在腫瘤細胞中特異性富集的聲敏劑分子血卟啉衍生物，産生具有高氧化活性的單線態氧等自由基，能有效地殺腫瘤細胞從而治療癌症的新方法。

　　學者主要提出超聲空化效應、單線態氧理論、自由基理論等，但聲動力學療法對腫瘤細胞作用的生物學機制仍不清楚。在超聲激活血卟啉殺傷癌細胞的研究中，通過掃描電鏡、透射電鏡以及PI-HO和Annexin V-PI熒光雙染，觀察受損後細胞形態結構的變化，曾發現處理後的S180和艾氏腹水腫瘤細胞(EAT)有核物質凝集、趨邊排列以及凋亡小體的形成等細胞凋亡特征，提示聲動力學療法不僅能直接殺傷腫瘤細胞，還可通過誘導腫瘤細胞凋亡來治療癌症。前期聲動力學療法抗癌的形態學研究發現，線粒體是較爲敏感易變的細胞器之一，它不僅是細胞的能量代謝中心，氧自由基的重要産生部位，而且與脊椎動物細胞凋亡的調控密切相關。本實驗采用頻率爲1.43MHz，聲強爲3.0W/cm²的高頻聚焦超聲和濃度爲0.025mg/ml的血卟啉處理艾氏腹水腫瘤細胞，通過檢測3種促凋亡蛋白的表達、超氧化物歧化酶的活性以及膜脂質過氧化物的含量，研究超聲激活血卟啉誘導艾氏腹水瘤細胞的凋亡機制及其與氧自由基的關系。

　　測試設備：ATA-M110高頻功率放大器模塊、昆明系小白鼠、艾氏腹水腫瘤細胞系、超聲探頭、血卟啉衍生物爲單羟乙基單乙烯基次卟啉、細胞色素c和Bax單克隆抗體、caspase-3單克隆抗體、鏈黴卵白素SP試劑盒。

　　實驗過程：

　　接種艾氏腹水腫瘤細胞于10只小鼠腹腔1周後，隨機取5只小鼠(其余5只備用)，抽取腹水細胞，分別置于醫用薄壁試管(含RPMI 1640+10%小牛血清培養基)，于37℃CO₂孵箱培養。實驗時用生理鹽水調整細胞濃度至3×10⁶cells/ml。每只小鼠抽取的腹水細胞再分爲4管，每管0.5ml細胞懸液，分別設爲對照組(CT)、血卟啉組(H)、超聲組(Us)和超聲加血卟啉組(UH)。H組和UH組每管中加入血卟啉5μl，使其終濃度爲0.025mg/ml，37℃CO₂培養箱孵育45min，Us組和UH組分別在頻率爲1.43MHz，強度爲3.0W/cm²的超聲裝置中聲照處理3min。各實驗組分別于不同時間段取材處理。實驗重複3次，以確認實驗結果的穩定性。

　　免疫細胞化學檢測Bax，細胞色素c，caspase-3蛋白表達各實驗組分別于超聲處理後0h，1h，3h取材。常規細胞塗片，丙酮固定10min，PBS洗滌3次，每次5min；含0.3%TritonX-100的PBS處理10min，以增加膜通透性，PBS洗滌3次，每次5min；0.3%H₂O₂-甲醇于37℃處理15min，封閉內源性過氧化物酶，PBS洗滌3次，每次5min；正常山羊血清于37℃封閉30min，封閉非特異性結合位點；分別滴加抗Bax、細胞色素c和caspase-3单克隆抗体(1∶100，1∶50，1∶500)，4℃孵育過夜，陰性對照組以0.01mol/L磷酸鹽緩沖液(PBS)取代一抗；加入的二抗爲生物素標記羊抗兔IgG或生物素標記羊抗小鼠IgG，室溫孵育1h，PBS洗滌3次，每次5min；滴加辣根酶標記鏈酶卵白素工作液，室溫孵育1h，PBS洗滌3次，每次5min；DAB顯色，梯度酒精脫水，中性樹膠封固蓋片。

　　實驗結果：

　　根據免疫細胞化學光鏡觀察結果和兩因素重複測量方差分析可見，不同處理方法對Bax，細胞色素c和caspase-3蛋白有極顯著影響，不同取材時間對這三種凋亡蛋白亦有極顯著影響。Tukey HSB法多重比較顯示：0h時各實驗組之間無顯著性差異(P>0.05)；處理1h時，UH组的3种促凋亡蛋白表达均高于其它3个處理组(U，H和CT組)，差異極顯著(P<0.01)；3h時，U組和UH組3種蛋白表達均比CT組和H組高，差異極顯著(P<0.01)，UH組的蛋白表達高于U組，差異極顯著(P<0.01)。而3種促凋亡蛋白表達的時滯效應分析結果也表明：各實驗組中CT和H組的3種促凋亡蛋白隨時間延長表達量無顯著變化；U组的蛋白表达量在處理3h時显著升高；UH組的蛋白表達量隨時間延長持續升高(平均光密度值表示陽性細胞蛋白表達強度，平均光密度值越小則表達信號越強)。

　　EAT細胞中SOD活力和MDA水平測定結果，超聲+血卟啉處理EAT细胞后1h取材，發現與CT和H組相比，U組的SOD活力略有降低，但不顯著(P>0.05)，細胞膜脂質過氧化水平無顯著變化(P>0.05)，UH組的SOD活力顯著降低，細胞膜脂質過氧化水平顯著升高。(P<0.01)

　　表1：Tukey HSB法对不同取材时间Bax、細胞色素c和caspase-3平均光密度值(×10^-4)的多重比較

　　圖1：不同時間段取材各組Bax蛋白平均光密度值變化

　　圖2：不同時間段取材各組細胞色素c蛋白平均光密度值变化

　　安泰ATA-M110高頻功率放大器模塊：

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